苏州大学殷黎晨Sci.Adv:吸入免疫抗菌剂治疗慢性阻塞性肺病!

2024-02-12 BioMed科技 BioMed科技 发表于陕西省

苏州大学殷黎晨开发了一种免疫抗菌剂,旨在结合抗菌治疗和促进炎症消退的免疫疗法。IMAMs由头孢他啶包裹的空心介孔二氧化硅纳米颗粒构建,并通过可变电荷/构象的多肽进行门控。

慢性阻塞性肺病(COPD)急性加重期的有效治疗方式和药物给药策略尚不充分。在此,苏州大学殷黎晨开发了一种免疫抗菌剂(IMAMs),旨在结合抗菌治疗和促进炎症消退的免疫疗法。IMAMs由头孢他啶(CAZ)包裹的空心介孔二氧化硅纳米颗粒(HMSNs)构建,并通过可变电荷/构象的多肽进行门控。这种多肽在中性pH下呈现负电荷、随机卷曲的构象,遮盖HMSNs的孔隙以防止抗生素泄漏,并允许雾化的IMAMs高效穿透支气管粘液和生物膜在生物膜的酸性环境中,多肽转变为带正电荷的刚性α螺旋,增强生物膜的保留并揭开孔隙以释放CAZ。同时,多肽被条件性激活,以破坏细菌膜并清除细菌DNA,作为CAZ的辅助剂来根除定植于肺部的细菌,并抑制Toll样受体9(TLR9)的激活以促进炎症消退。这种免疫抗菌策略可能会改变当前COPD管理的范式。该研究以题为“Inhaled immunoantimicrobials for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease”的论文发表在《Science Advances》上。

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图1展示了免疫抗菌剂(IMAMs)穿透粘液和生物膜进行COPD免疫抗菌治疗的示意图。IMAMs由头孢他啶(CAZ)封装在空心介孔二氧化硅纳米颗粒(HMSNs)中,并通过可变电荷/构象的多肽进行门控。在中性pH条件下,多肽呈现负电荷和随机卷曲构象,这有助于IMAMs在雾化后高效穿透粘液和生物膜。一旦进入生物膜的酸性环境,多肽会转变为带正电荷的刚性α螺旋,这不仅增强了生物膜的保留,还揭开了HMSNs的孔隙以释放CAZ。同时,这种结构转变激活了多肽,使其能够破坏细菌膜并清除细菌DNA,作为CAZ的辅助剂,共同消除肺部定植的细菌,并抑制Toll样受体9TLR9)的激活,促进炎症消退。这些特性使得IMAMs成为一种有前景的治疗COPD的策略,可能改变当前COPD管理的范式。

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图1.IMAMs穿透粘液和生物膜用于COPD免疫抗菌治疗的示意图

IMAM的制备和表征】

图2展示了IMAMs的制备和酸触发的构象转变特性。通过在HMSNs表面引入带有正电荷的季铵胺和负电荷的羧基的多肽,制备了带有负电荷的随机卷曲构象的多肽修饰的纳米颗粒(MEKCA NPs)。这些多肽在中性pH下由于侧链间的静电吸引而呈现负电荷,而在酸性环境中,羧基被去除,多肽转变为带正电荷的刚性α螺旋,从而揭示了HMSNs的孔隙以释放封装的CAZ。这一转变过程伴随着颗粒尺寸的增加和ζ电位由负转正,以及在pH 6.5下CAZ的累积释放率显著提高。这些结果表明,IMAMs能够在酸性生物膜环境中实现药物的按需释放,同时多肽的构象转变增强了对细菌膜的破坏能力,有助于清除肺部定植的细菌并促进炎症消退。

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图2.IMAM的表征和酸触发转化

MEKCANPs在体外和体内的粘液渗透】

图3展示了IMAMs在体外和体内的粘液穿透能力和肺组织分布。研究首先评估了Cy5标记的MEKCA NPs(Cy5MEKCA NPs)在囊性纤维化(CF)患者的脓性痰液中的传输效率,发现负电荷的Cy5MEKCA NPs的传输效率是正电荷Cy5MEK NPs的八倍。通过多粒子追踪(MPT)实验,观察到Cy5MEKCA NPs在CF痰液中的布朗运动范围显著大于Cy5MEK NPs,有效扩散系数(Deff)也显著提高。此外,通过光漂白实验验证了Cy5MEKCA NPs在粘液中的扩散行为,发现其在光漂白区域的荧光强度下降与NPs的扩散效率呈负相关。在体内,通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察到,Cy5MEKCA NPs能有效穿透粘液屏障,主要分布在肺上皮的深层区域,而Cy5MEK NPs则主要定位在杯状细胞上方,表明Cy5MEKCA NPs在粘液穿透方面具有显著优势。这些发现共同证实了MEKCA NPs在体外和体内均表现出良好的粘液穿透能力,这主要归因于它们对粘液吸附的抵抗性。此外,MEKCA/CAZ NPs在雾化后表现出良好的稳定性,尺寸未发生变化,CAZ释放水平低

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图3. IMAM 的粘液渗透和肺潴留

MEKCA/CAZ NPs的生物膜渗透和抗菌效率】

图4展示了IMAMs在体外对生物膜的穿透能力和抗菌效率。研究制备了P. aeruginosa生物膜,并用Cy5标记的NPs进行观察,结果显示负电荷的Cy5MEKSA NPs在生物膜中的积累几乎可以忽略,而Cy5MEK NPs的红色荧光随着深入生物膜而显著减弱,表明正电荷NPs与EPS基质有较强的静电吸引,限制了其在生物膜中的穿透。相比之下,Cy5MEKCA NPs在整个生物膜中分布明显,穿透深度超过2.7微米,这得益于酸触发的电荷反转从负到正。随后,研究了NPs的抗菌效率,发现MEKCA NPs在pH 6.5时能有效杀死大肠杆菌、P. aeruginosa和金黄色葡萄球菌,而在pH 7.4时MIC显著升高,表明MEKCA NPs在酸性条件下具有条件性抗菌效率。非可转换的MEKSA NPs在pH 6.5时也表现出较弱的抗菌能力。此外,DL-MEKCA NPs由于其α螺旋结构的强膜破坏活性,对三种测试菌株的MIC比MEKCA NPs高四倍。FE-SEM观察显示,MEKCA NPs处理后细菌膜破裂变形,表明NPs上的阳离子螺旋多肽能有效通过破坏细菌膜来杀死细菌。封装抗生素CAZ后,MEKCA/CAZ NPs在pH 6.5时表现出更强的抗菌效果,与自由CAZ和MEKCA NPs相比,MIC显著降低。这些结果表明,MEKCA NPs不仅具有强大的生物膜穿透能力,还能通过酸触发的构象转变和膜破坏活性,以及与抗生素的协同作用,有效消除肺部定植的细菌。

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图4.IMAMs的体外生物膜渗透和抗菌活性

MEKCANP介导的cfDNA清除和体外抗炎作用】

图5展示了IMAMs在体外对细胞游离DNA(cfDNA)的清除和抗炎效果。研究首先通过收集急性加重期COPD(AECOPD)患者的痰液,发现与健康志愿者相比,AECOPD患者的痰液中cfDNA水平、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮合酶(iNOS)水平显著升高,且cfDNA水平与AECOPD的严重程度呈强相关性。接着,研究了MEKCA NPs在pH 6.5时对cfDNA的清除效率,结果显示MEKCA NPs能显著降低痰液中的cfDNA水平,主要通过阳离子多肽与cfDNA之间的强静电相互作用。进一步分析cfDNA的组成,发现MEKCA NPs处理前后细菌DNA与总cfDNA的比例保持不变,但细菌DNA的组成有所变化,这可能是因为革兰氏阳性菌的厚细胞壁阻碍了细菌DNA的释放。此外,MEKCA NPs还能有效清除细菌gDNA,阻止TLR9途径的激活,从而抑制免疫细胞的异常激活。在HEK-Blue mTLR9细胞中,MEKCA NPs显著降低了gDNA诱导的TLR9激活。在中性粒细胞和巨噬细胞中,MEKCA NPs处理后,gDNA激活的中性粒细胞数量和分泌的TNF-α及IL-6水平显著降低。这些结果表明,MEKCA NPs不仅具有杀菌活性,还能通过清除细菌DNA来抑制炎症,为COPD管理提供了一种新的策略。

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图5.IMAMs的体外cfDNA清除和抗炎功效

MEKCA/CAZ NP介导的体内抗菌作用】

图6展示了IMAMs在COPD小鼠模型中的抗菌和抗炎效果。研究首先建立了COPD小鼠模型,通过吸烟处理、气管内脂多糖(LPS)挑战和P. aeruginosa感染。随后,COPD小鼠接受了MEKCA/CAZ NPs的雾化治疗。结果显示,MEKCA/CAZ NPs显著减少了BALF中的细菌菌落数量,与CAZ治疗相比,MEKCA/CAZ NPs处理后细菌菌落数量显著减少,接近未感染小鼠的水平。此外,MEKCA/CAZ NPs显著降低了血清和肺组织中的促炎细胞因子水平,包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8,优于单独的MEKCA NPs和CAZ。这些发现表明,MEKCA/CAZ NPsCOPD小鼠中具有显著的抗菌和抗炎效果,能够有效地消除肺部定植的细菌并减轻肺部炎症,这可能有助于改善COPD小鼠的病理生理状态。

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图6.IMAMs在COPD小鼠中的抗菌和抗炎功效

MEKCA/CAZ NP介导的体内炎症消退】

图7展示了IMAMs在COPD小鼠模型中促进炎症解决和肺功能恢复的效果。研究中,COPD小鼠在接受了MEKCA/CAZ NPs的雾化治疗后,BALF中的总细胞计数显著减少,特别是中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著降低,接近健康小鼠的水平。MEKCA/CAZ NPs还有效地将巨噬细胞从促炎的M1型极化转变为抗炎的M2型,同时恢复了肺组织中其他免疫细胞如辅助T细胞和细胞毒性T细胞的正常水平。此外,MEKCA/CAZ NPs治疗显著改善了COPD小鼠的肺功能,包括动脉血氧分压(PaO2)的升高、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)的降低以及血液pH值的改善。这些结果表明,IMAMs不仅能够抑制免疫细胞的浸润,防止免疫细胞向促炎表型分化或极化,而且能够促进有效的炎症解决,为COPD的治疗提供了一种新的策略。

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图7.IMAM介导的COPD小鼠炎症消退和肺功能恢复

【小结】

该研究开发了一种新型的免疫抗菌剂(IMAMs),它结合了抗菌治疗和促进炎症消退的免疫疗法,用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)的急性加重期。IMAMs由头孢他啶(CAZ)封装在空心介孔二氧化硅纳米颗粒(HMSNs)中,并通过可变电荷/构象的多肽进行门控。这种设计使得IMAMs能够在酸性生物膜环境中实现药物的按需释放,同时多肽的构象转变增强了对细菌膜的破坏能力,有助于清除肺部定植的细菌并促进炎症消退。COPD小鼠模型中,IMAMs显示出显著的抗菌和抗炎效果,能够有效地消除肺部定植的细菌,减轻肺部炎症,改善肺功能,并且促进炎症的解决。这些发现表明,IMAMs可能为COPD的管理提供了一种新的治疗策略,有望改变当前COPD治疗的范式。

原文链接:

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abd7904

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