Nat Biotech：一次生产10亿CAR-T细胞，新型CRISPR技术，无需病毒载体高效插入超长DNA序列
2022-09-11 nagashi “生物世界”公众号
常规CRISPR技术通常依靠病毒载体来递送到细胞中，但病毒载体往往成本高昂且耗费资源，因此，制造大量临床级病毒载体一直是CRISPR技术临床应用的主要瓶颈之一。
CRISPR技术的出现显着改变了基因编辑领域的格局，为科学家自由操纵基因提供了前所未有的简便和高效。然而，目前CRISPR技术并非完美无缺，仍存在一定局限性，并面临许多挑战。
常规CRISPR技术通常依靠病毒载体来递送到细胞中，但病毒载体往往成本高昂且耗费资源，因此，制造大量临床级病毒载体一直是CRISPR技术临床应用的主要瓶颈之一。此外，传统病毒载体（慢病毒载体）在基因组中插入基因的位点具有随机性，难以对其进行精准控制，因此具有潜在致癌性风险。
近日，美国加州大学旧金山分校的研究人员在 Nature Biotechnology 期刊发表题为：High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails 的研究论文。
该研究开发了一种改进型CRISPR-Cas9基因编辑技术，无需病毒载体即可非常高效地将长DNA序列精准引入细胞基因组的精确位置，实现比常规CRISPR技术高2-3倍的编辑效率。而且，能够一次性产生高达10亿个CAR-T细胞，这为下一代安全高效的基于CRISPR的细胞疗法打开了新的大门。
在经典的CRISPR-Cas9基因编辑技术中，需要使用高浓度的双链DNA（dsDNA）和Cas9靶序列来增强CRISPR介导的插入效率，但这可能对原代细胞产生较强的毒性。与之相对，单链DNA（ssDNA）对细胞的毒性较小，即使在相对较高的浓度下也是如此。
此外，为了克服常规CRISPR技术需要病毒载体的弊端，多年以来，研究团队一直致力于将更长的DNA序列以一种不依赖病毒载体的方式插入到基因组中的特定位点，并实现更高效的基因编辑。
在这最新研究中，研究团队开发了一种新型CRISPR系统，利用结合Cas9靶序列的单链DNA（ssDNA）HDR模板（HDRT），实现了相对于dsDNA的2-3倍的敲入效率和产量。此外，这种方法不依赖于病毒载体，允许科学家将特别长的DNA序列引入细胞基因组的精确位置。
新型CRISPR系统的开发
不仅如此，研究团队还展示了如何利用新型CRISPR系统来快速生产CAR-T细胞。CAR-T细胞是近年来十分火热的免疫疗法，该技术从患者身上取下T细胞并对其进行改造，在对抗多发性骨髓瘤等血液肿瘤血癌展现出良好的前景。
研究团队使用新的DNA模板生成了超过10亿个靶向多发性骨髓瘤的CAR-T细胞，其中大约一半的T细胞获得了新基因并转化为CAR-T细胞。研究人员将DNA模板定位到基因组中的一个特定位置，称为TRAC位点，这有助于提高CAR-T细胞的抗肿瘤能力。
利用新型CRISPR系统来快速生产CAR-T细胞
该研究的第一作者Brian Shy博士表示，他们开发的新型CRISPR系统可以在一次运行中设计超过10亿个CAR-T细胞，这远超治疗单个病人所需的细胞数量。并且，由于不需要昂贵的病毒载体，这种新型CRISPR系统不受成本、制造复杂性和供应链挑战的限制，使得新的细胞和基因疗法更快、更好、更便宜。
新型CRISPR系统可以在一次运行中设计超过10亿个CAR-T细胞
此外，研究人员首次表明，他们的方法可以完全替代与罕见遗传免疫疾病相关的两个基因，即IL2RA和CTLA4。过去已有研究证明可以替换IL2RA基因的突变片段，如今，这项最新研究表明，可以一次性替换整个IL2RA和CTLA4基因，这是一种“一刀切”的方法，可以同时治疗在同一个基因上有不同突变位点的患者，而不必为每个患者的突变生成个性化的模板。
治疗和诊断的靶基因的全ORF替换人类T细胞编辑
更重要的是，研究结果显示，用这种基因工程方法处理的细胞中，近90%获得了健康的基因版本。目前，研究团队正推进在CAR-T细胞治疗和IL2RA基因缺陷治疗中使用这种新型非病毒CRISPR技术的临床试验。
总的来说，这项发表在 Nature Biotechnology 上的研究开发了一种新型的、不依赖病毒载体的CRISPR-Cas9基因编辑系统，实现比常规CRISPR技术高2-3倍的编辑效率。这种新的非病毒方法能够更有效地实现靶向性，并加速下一代CAR-T细胞疗法的发展。
原始出处：
Shy， B.R.， Vykunta， V.S.， Ha， A. et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol (2022). https：//doi.org/10.1038/s41587-022-01418-8.
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