复旦大学附属中山医院检验科副主任郭玮：液体活检临床应用的热点和思考
2017-09-25 郭玮 转化医学网
近年来，随着科学研究的深入与检测技术的发展，伴着肿瘤靶向药物治疗的精进与精准医疗的热潮，液体活检因其无创性、准确性、动态性及其可行性受到了极大关注，这些特点让掌握肿瘤的发生发展动态过程成为可能，恰恰也是医疗大数据、精准医学和个性化治疗迫切需求的。
近年来，随着科学研究的深入与检测技术的发展，伴着肿瘤靶向药物治疗的精进与精准医疗的热潮，液体活检因其无创性、准确性、动态性及其可行性受到了极大关注，这些特点让掌握肿瘤的发生发展动态过程成为可能，恰恰也是医疗大数据、精准医学和个性化治疗迫切需求的。
液体活检在临床应用中主要是循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤核酸(ctDNA)。CTC的理念提出最早，转化应用于临床也初见成效，但是近年来其进一步临床应用受到了挑战，而ctDNA在肿瘤靶向治疗中迅速崛起。
近日，2017年全国检验医学学术大会在美丽的杭州顺利召开，其中液体活检分会场备受瞩目，复旦大学附属中山医院检验科副主任郭玮教授带领我们共同探讨了液体活检在肿瘤诊疗中的热点和思考。
1、伴随诊断，治疗监测
基于外周血的液态活检有利于临床在肿瘤患者治疗过程中实施多点，动态的连续监测。在众多液态活检指标中，循环肿瘤DNA（ctDNA）的诸多特征决定了其更符合监测的临床需求。例如较短的半衰期、全面的信息覆盖能力以及ctDNA突变丰度的变化与肿瘤负荷相一致等特点。
以靶向治疗耐药监测为例，由于ctDNA包含了大量肿瘤细胞来源的，决定肿瘤特性（包括药物敏感性）的遗传学特征，再加上高灵敏的ctDNA检测技术，动态的耐药突变监测能有效的帮助临床医生在影像学发生改变之前，更早期发现耐药克隆的演化，并辅助临床医生及时对症下药，精准地调整治疗方案。
相比常规的血清肿瘤蛋白标志物，如CEA，CA199，ctDNA在特异性、灵敏度，后续治疗的指导性方面都远超前者。值得提出的是，虽然相关临床应用可行性已经在部分探索性研究中得到了有力的支持。但诸如ctDNA产生的机理到底为何；血浆ctDNA和正常的cfDNA如何有效的区分；如何用一种比较标准化的手段来衡量不同生物信息算法的结果（ctDNA对生物信息学的要求较ctc更为依赖）等，有待于更系统、更深入的临床研究。
2、血检先行？
第三代EGFR-TKI药物奥希替尼，是推动ctDNA临床应用最有力的推手。在奥希替尼诞生之前液体活检只是作为组织活检的有效补充，奥希替尼伴随诊断T790M的检测使得液态活检一跃成为相关临床检测路径上的优选，真正地实现了血检先行。
由于奥希替尼针对的是一代TKI药物耐受的晚期非小细胞肺癌患者。作为获得性耐药突变的T790M无法从原有的组织检材中检出，而二次穿刺或支气管镜活检无论是在患者接受度、活检成功率，活检并发症风险上都充满挑战，利用ctDNA进行的非侵入性的T790M检测则有效地解决了上述临床痛点。
2017年NCCN非小细胞肺癌诊疗指南中对T790M检测的相关临床应用给出了具体的路径。其中提出『在组织活检不可行的情况下，可考虑行血浆ctDNA检测。如果T790M为阴性，则再次建议患者行组织活检』。而在EMSO的相关指南中则更是明确了在该检测上血检的优先权。
指南的描述充分体现了两个层面的信息，也代表了ctDNA临床应用的两个特点，一个是ctDNA检测具有高特异性，因此有它即可，才能先行；二个是ctDNA检测相比组织活检，仍有相当的假阴性比例，组织活检结果仍对于最终药物使用起到决定性价值。
综上所述，在诊断标准层面，组织活检仍是金标准，但在检测方法上血检和组织活检是互补的两种方法；在临床应用路径上，具体谁先行，需结合具体情况进行选择。
3、如何看待血浆ctDNA结果与组织活检不一致
涉及到与组织不一致的情况的影响因素有很多。因此应从多方面看待ctDNA与组织活检检测结果：
1）病人状态：患者的病情状态，如临床分期，肿瘤负荷大小，处在治疗的不同阶段等均决定了ctDNA的检出率。早期的，肿瘤负荷较低的，有效治疗后的血浆中cfDNA的总量和ctDNA的水平都相对较低。上述情况下检测ctDNA，更易发生组织阳性，而血浆阴性的情况。
2）肿瘤异质性： 患者肿瘤内部的异质性越大——这种异质性的根源既可以来自于肿瘤自身的演化如转移，也可以来自于外界的选择压力如药物治疗，单点的组织活检越不能反应整个肿瘤灶的情况。而相比之下，ctDNA来源的肿瘤克隆更多元化，更能反映肿瘤全貌，但也更易发生血浆阳性，组织阴性的情况。
3）检材质量：标准规范化的采血，血浆制备，ctDNA提取，ctDNA储存的标本对ctDNA最终检测结果至关重要。例如不同类型的采血管会影响ctDNA的吸附性损失，血浆制备的时间窗会影响到ctDNA降解及背景gDNA的污染，抽提过程中各种长度ctDNA的回收效率，这都会影响到ctDNA突变的检出率。
4）检测方法：检测技术类型的内在局限性（如检测下限），检测平台的性能（灵敏度和特异性）、方法适用性（能检测的突变类型，对检测热点突变和de novo突变的检测能力）、实际操作（人员的操作能力，主要体现在重复性上）都决定了ctDNA突变的检出情况。
5）数据分析：生信分析（主要侧重点在NGS）、结果判读（数字PCR，ARMs和MALDI-TOF）、标准建立（NGS，数字PCR和ARMs等其他方法均需要建立自己特定的体系。缺乏客观，统一的数据分析标准，导致了数据分析方法的多元化，也会影响了ctDNA突变的检出。
上述的不一致性，整体上看一部分来自于生物学原因，但相当一部分是源于ctDNA检测目前尚缺乏系统、标准、规范化管理所导致的，后者对于临床实验室还是对于监管部门都是极大的挑战。
4、液体活检标本类型的多样化
除了现在提及最多的血浆，包括之前临床已经开展的胸水EGFR检测，无论是脑脊液和尿液均可作为液体活检标本的类型。随着埃克替尼以及奥希替尼均被证实具备穿透血脑屏障直接作用于脑部肿瘤的能力，脑脊液ctDNA的检测无论是指导靶向用药策略还是判断肿瘤的来源均具有极高的临床价值。相比较而言，取材最为方便的尿液，实现真正的自主采样，无创检测，尤其适合开展定性的突变监测。考虑在单一样本类型检测结果与临床不符的情况，结合多标本类型进行检测可能具有更好的临床应用前景。
5、选择最合适的液体活检方法
选择合适的液体活检方法，应优先应考虑临床应用场景，应用场景决定了检测的灵敏度，检测周期，检测成本等需求，从而有助于我们匹配不同检测平台的特点进行综合考虑。例如：1）治疗监测/微小残留病灶/早期诊断-血浆（灵敏度高的方法学，需具备定量分析能力），2）初次用药选择-组织（灵敏度相对低的方法学，定性即可基本满足需求）+血浆（灵敏度高的方法学，定性即可基本满足需求），等场景）。
平台本身的性能：操作繁易程度，突变位点覆盖率，实验TAT，标本用量。检测灵敏度和特异性，LDT/商品化试剂盒。
6、试剂盒？LDT？
液体活检试剂盒一般应满足以下几个IVD行业试剂盒的特点：1）设备精准 2）数据信息化 3）试剂简单化 4）质控标准化 5）操作简易化 6）产品智能化 7）结果专业化 。目前几乎所有的检测平台（NGS、ddPCR、ARMs、MALDI-TOF和BEAMing）均有配套的检测试剂盒，其中NGS会有众多厂商提供的不同的文库制备试剂盒，到了终端测序仪则会有统一的试剂提供。根据检测试剂盒中所提供的SOP进行规范化操作即可完成一次检测，无论是NGS还是ddPCR和ARMs等，试剂盒的操作均经过大规模的批量性能测试和监管层的严格评估。对于临床实验室而言，试剂盒的最大优势即标准化，在检测人员技术过关，仪器稳定的情况下，结果的优良主要取决于检测试剂盒本身的性能。
鉴于数字PCR平台本身的反应原理近似于qPCR（Taqman探针），条件研发能力和平台应用能力相对要求较低，在可预见的一段时间，该平台会成为临床实验室开展LDT的优先选择。这里需要提出液体活检LDT的规范管理包括：1）创新和发展，科学合理监管 2）医学检验部门负责人应该对开展LDT负主要责任 3）正式对临床开展前应完成检测性能与临床应用评估 4）完善室内质量控制体系 5）编写相应的从标本采集到结果解释全过程的规范化操作规程 6）密切和临床医生沟通合作，共同做好结果解释工作。因此，相对商品化试剂盒而言，LDT需要做的更多，对实验室的检测能力以及管理水平均提出极大的挑战。
总之，在试剂盒还是LDT的选择上，诸如NGS、ARMs、MALDI-TOF和BEAMing的LDT均具备较大的难度，相对而言ddPCR或许是适合开展LDT的平台。
7、规范操作流程 重视结果解释
规范操作流程
1）采血管与保存、前处理：离心、抽提、运输。
2）操作步骤： 合适的质控品选择，恰当的质控点设置（如抽提的质控，检测过程中的质控（NGS还会涉及到部分环节设定的质控，如qubit定量，片段分析等））、标准化SOP流程的制定。
3）人员规范培训：人员的操作规范、实验室环境监控和仪器设备维护保养。
重视结果解释
1）临床可报告范围：这包含了两个层面的考量，什么样的突变可报——尤其是对于NGS 这类高通量突变检测平台；什么量的突变可报——尤其是对于检测灵敏度特别高的平台。相关原则的设立，应依赖和医生长期合作以及大量询证医学证据的基础上获得的。
2）结果报告规范： 给出碱基的变化-氨基酸的变化，具体变化对应的临床含义。具备定量分析能力的仪器，应报告具体的拷贝数以及突变丰度：『突变/(野生+突变)』。
3）检测位点特性：常见的包括突变/缺失/拷贝数变异/融合等，均需按照标准的格式进行标注。
液体活检作为一项富有挑战性的新技术，检测外周血液中来自于肿瘤细胞的ctDNA和CTCs等，具有采样方便、无创、反映肿瘤全貌、可连续多次监测等优势，可广泛用于肿瘤诊断分型、治疗用药的药物敏感基因检测（药物治疗伴随诊断）、病情监测和预后评估等，实验室须规范操作流程，重视结果解释，加强临床与检验的沟通。产、医、研多方紧密结合共同推进液体活检在医学诊疗的迅猛发展。
关于郭玮主任：
郭玮，复旦大学附属中山医院检验科副主任。毕业于上海医科大学医学检验专业。博士、博士生导师。
社会任职：中华医学会检验医学分会第九届委员会青年委员会委员、上海市医学会检验医学分会第十届委员会委员、上海市抗癌协会检验医学专业委员会副主任委员、中华医学会检验医学分会临床生化学组成员、上海市医学会检验医学分会质谱学组组长、《检验医学》等多本杂志编委。
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