Leukemia：髓外骨髓瘤最全面二代测序，揭示关键分子学特征和肿瘤微环境

髓外骨髓瘤的分子学特征

髓外多发性骨髓瘤 (EMM) 是多发性骨髓瘤 (MM) 的一种侵袭性形式，容易发生治疗耐药和生存期较短。据报道，EMM的发生率在诊断时为1.7-4.5%（原发性EMM），复发时则高达43%（继发性EMM），三类暴露MM中的EMM发生率也远高于既往。由于新药以及现代成像技术（如PET/CT）的可用性改善，MM 患者的生存期也得以延长。因此，EMM正在成为临床重要的问题，但介导 EMM 发生的分子机制，以及肿瘤微环境的组成，仍知之甚少，而它们对新型免疫治疗的疗效至关重要。

尚无研究对 EMM 进行详细的基因组或转录组学分析。关注染色体畸变的研究样本有限且存在偏倚，例如使用预选的 FISH 靶标，且小的体细胞突变多使用靶向 panel 进行分析，排除了绝大多数的人类基因。也几乎没有直接从 EMM 肿瘤细胞获得的转录组学数据。

捷克学者进行了 EMM细胞最全面的研究，结合14例 EMM 患者FISH、全外显子测序 (WES)、bulk RNA 测序 (RNA-seq)、单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和流式细胞术的数据。重要的是，还获得了8对骨髓异常 PC 样本的基因组和转录组学数据（从诊断到复发），这也是 EMM 的首次纵向研究。研究结果近日发表于《Leukemia》。

研究结果

该研究纳入14例EMM患者并收集样本，包括14份来自软组织肿瘤活检的 EMM 样本和14份来自新诊断MM(NDMM) 的 BM 样本，其中包括8份配对样本和6份未配对，此外14例复发性/难治性MM(RRMM) 患者未配对 BM 样本（无 EMM 证据）。所有样本均用于 RNA 测序 (n=42)，EMM和配对的NDMM样本也用于WES(n=22)，部分EMM样本处理后进行单细胞测序 (n=5)（图1）。

临床特征和EMM复发

RRMM 患者中共14例（男性10例，女性4例）行软组织肿瘤活检并确诊为EMM（图2）。

EMM复发时的中位年龄为59岁，距诊断的中位时间为22.2个月，距 EMM 复发时的中位总生存期仅为3.6个月（图1）。既往治疗线的中位数为3，大多数患者接受过PI、IMiD、皮质类固醇和烷化剂联合治疗。14例患者中的6例在 EMM 复发前接受过达雷妥尤单抗治疗。EMM 复发患者在复发时血清电泳定义的 M 蛋白水平与非 EMM 复发患者相比显著下降（中位数5.8 g/L vs. 14.4 g/L；p=0.011），但游离轻链水平无差异。通过细胞学 (2.8% vs. 14.4%；p=0.023) 或流式细胞术 (0.5% vs. 8.3%；p=0.05) 评估，EMM复发患者的 BM PC 浸润显著较低。在几乎所有 EMM 复发患者中，恶性 PC 的轻微 BM 浸润均转化为正常血细胞计数（中位白细胞计数5.1×10⁹/L；中位中性粒细胞绝对计数2.4×10⁹/L；中位血红蛋白水平12.0 g/dL；中位血小板计数168×10⁹/L）。

1q21gain/amp是 EMM中最常见的染色体畸变

14例 EMM 样本中，在12/14例样本（86%；5例gain和7例amplification）中检测到（通过 FISH 和/或WES）跨越 CKS1B 基因的 1q21 gain或amplification（≥4拷贝）（图3A）。包括RB1在内的13q缺失8例(57%)，包括TP53在内的17p缺失6例(43%)。令人惊讶的是，高危t(4;14)仅存在于2例患者(14%)。通过RNA-seq数据验证了这一发现，显示FGFR3表达升高和/或FGFR3-IGH融合转录本的存在。利用WES数据进行的详细拷贝数分析进一步发现，在14例EMM样本中，有4例存在癌基因扩增、抑癌基因(tsg)缺失和CD38缺失。

几乎所有EMM样本中MAPK通路成员均发生突变

在几乎所有的 EMM 样本中均鉴定出 MAPK 信号通路中至少有一个突变基因（13/14，93%；3B），其中 KRAS是最常发生突变的基因（10/14，71%；图3B）；此外在2例 (14%) 样本中发现 NF1 和 NRAS 突变，在1例 (7%) 样本中发现 BRAF 和 HRAS 突变。MAPK 通路的突变总是克隆性的，癌细胞片段携带比例> 0.8，表明它们在髓外肿瘤形成之前出现。57%的 EMM 样本存在与基因组完整性相关的基因突变，其中 TP53 是最常见的突变TSG(5/14；36%)。EMM 中经常突变的最后一组基因为属于 MAPK 通路上游受体酪氨酸激酶 (RTK) 信号通路的基因。

使用 RNA-seq 数据证明，上述突变中至少80%转录为mRNA，并推测翻译成最终的蛋白产物。值得注意的是，所有 TP53 突变的 EMM 样本均转录突变等位基因，变异等位基因频率 (VAF)≥0.9作为双等位基因失活的标志。在 RNA-seq 数据中，K/N/HRAS的所有突变的 VAF 至少为0.3。值得注意的是，仅在3/9(33%) 接受 ASCT 的患者中检测到美法仑标签（signature）。

NDMM患者中1q21 gain/amp和突变KRAS的组合预示着EMM发生的风险更高

由于 EMM 中 1q21 gain/amp 和 KRAS 突变频率较高，假设携带这两种异常组合的 NDMM 患者发生 EMM 的风险较高。在3/8(38%) 配对 NDMM 样本中，MM 诊断时已经观察到该组合（图3）。因此使用CoMMpass 研究中收集的数据（N=699），以支持该假设，即仅 1q21 gain/amp 与 KRAS 突变联合（7.6%的患者），而非任何一个的单独（仅 1q21 gain/amp 或 KRAS 分别为29.8%和17.7%），结果单因素分析 (HR=2.7；p=0.002) 和多因素 Cox 分析 (HR=2.4；p=0.011) 中软组织浆细胞瘤发生的风险显著较高。此外，使用 FineGray 模型对竞争风险（软组织浆细胞瘤发展与死亡，HR=2.4；p=0.011）进行生存分析，观察到几乎相同的结果。KRAS 突变或 1q21 gain/amp 与 del(13q) 或 del(17p) 之间均无相互作用。

EMM细胞的转录组学分析提示更高的增殖和减少归巢到BM

为进一步探索 EMM 的生物学特征，使用 RNAs测序 将14例 EMM 样本与8例样本配对的14例 NDMM 样本进行比较。共确定799个显著失调的蛋白编码基因（绝对 log2 倍数变化>1，Benjamini–Hochberg调整p<0.05），其中290个下调，509个上调（图4A）。通路富集分析发现，与 NDMM 相比，EMM中与细胞增殖相关的通路明显上调，与免疫反应相关的通路下调（图4B）。在最显著上调的基因中确定了人类癌症中常见的生物标志物：STC2、CACNA1C和GAGE2A；下调最多的基因为FCGR2B，它与 BM 中 PC 持续存在有关，对细胞凋亡、LYZ和 ITPRIP 的易感性更高。此外，去泛素化酶基因 OTUD1 的表达降低，与 MM 患者较差的预后相关。重要的是还检测到CXCR4（编码 PC 归巢至 BM 的关键分子）和整合素基因ITGA6（其下调与从 MM 进展为浆细胞白血病有关）的低表达。同样，CKS1B的表达增加可能是由于 1q21 gain。值得注意的是，PC的强效生长因子白细胞介素 6(IL6) 的表达上调，表明 EMM 肿瘤生长的自分泌调节。在几乎所有样品中观察到与重链相比，轻链 (IGL) 的产量更高（图4C）。与既往研究一致，检测到 EMM 中重要的表观遗传介质的表达显著高于MM：组蛋白甲基转移酶 (EZH2) 和三种人类 DNA 甲基转移酶中的两种（DNMT1和DNMT3B）。此外检测到33个下调和62个上调的lncRNA，其中与肿瘤进展相关的多种 lncRNA 上调，包括EPIC1、CASC9和 ZFPM2AS1。

EMM细胞中治疗相关靶标下调

由于抗骨髓瘤治疗（包括新型免疫治疗）在 EMM 中的疗效欠佳，重点研究了免疫治疗靶标的表达，其可预测治疗疗效。为了比较 MM 治疗关键分子靶标的表达，使用了与之前实验相同的 RNA-seq 数据（图4），且仅使用配对样本 (N=8) 进行差异表达分析，以更好地捕获纵向变化。

此外纳入14例不相关的 RRMM 样本，与无 EMM 的晚期 MM 进行比较，结果发现，目前用于 MM 治疗的重要分子靶点（CD38、SLAMF7和GPRC5D）的表达在EMM中显著下降，且FCRH5的表达有较低的强烈趋势（图5）。值得注意的是，未观察到 BCMA 下调。有趣的是EZH2 和 CD70 为高表达，这是其他恶性肿瘤中有希望的靶点。此外，EMM 细胞中 MHC-I 分子 HLA-B 和 HLA-C 的表达下降，其与其他癌症对免疫治疗的反应较差有关；但可能无临床相关性，因为这些基因仍属于最高表达基因。

CD8+ T和NK细胞是EMM肿瘤微环境中主要的免疫效应细胞

为更好地理解 EMM 肿瘤的生物学和组成，首次利用 scRNA-seq 对5例 EMM 患者的软组织肿瘤进行测序，获得了每个样本中位3916个细胞。大多数细胞为异常PC（中位数90.5%），其余主要是CD8+ T细胞、NK细胞、单核细胞和CD4+ T细胞（中位数分别为7%、1.8%、0.5%和0.2%；图6）。重要的是，CD8+ T和 NK 细胞是最丰富的免疫细胞，在流式细胞术中具有相当的比例。此外，EMM 细胞具有高度异质性 (图6)，可在典型的 PC 分子上进一步证明：例如，1例患者的 EMM 细胞几乎失去 CD38 的表达，另1例患者的肿瘤细胞 CD138 表达非常低。重要的是，这些数据与bulk RNA-seq 和流式细胞术数据一致。

总结

本研究介绍了迄今为止最大、最全面的 EMM 肿瘤细胞 NGS 研究(N=14)，描述了 EMM 的关键分子特征，包括重要治疗靶点的表达水平（图7），还利用 scRNA-seq 数据首次提供了对 EMM 肿瘤微环境组成的见解。

研究发现79%的 EMM 样本中同时存在1q21 gain/amp和 MAPK 通路突变，表明这些是 EMM 发生中至关重要的突变事件。还使用来自大型 CoMMpass 数据集的数据证明，诊断时 KRAS 突变和 1q21 gain/amp的患者发生 EMM 的风险显著更高 (HR=2.4，p=0.011)。CXCR4 下调和细胞增殖增强，以及治疗靶标 (CD38、SLAMF7、GPRC5D、FCRH5) 表达减少，或可解释免疫治疗疗效降低的原因；而EZH2 和 CD70 显著上调，是未来潜在的治疗选择。还首次报道 EMM 的肿瘤微环境，利用单细胞测序揭示了CD8+ T细胞和 NK 细胞是主要的免疫效应细胞。最后，该研究是首次在 EMM 中纵向研究揭示从诊断到 EMM 复发的分子学变化。

参考文献

Jelinek, T., Zihala, D., Sevcikova, T. et al. Beyond the marrow: insights from comprehensive next-generation sequencing of extramedullary multiple myeloma tumors. Leukemia (2024). https://doi.org/10.1038/s41375-024-02206-w