Cell：张泽民研究组揭示结直肠癌靶向髓系细胞的免疫治疗机理

免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint blockade, ICB）能够破坏肿瘤细胞对免疫监视的逃逸，极大地改变肿瘤病人的治疗模式 【1】。尽管基于免疫检查点开发的抑制剂药物，如PD-1抗体，在多种肿瘤治疗中取得良好疗效，然而在临床实验中仍有部分患者无法获益，如基因组微卫星稳定（Microsatellite stable, MSS）的结直肠癌病人【1-3】。

之前，张泽民团队与合作者开发了STARTRAC生物信息学方法，首次对结直肠癌单个浸润T淋巴细胞的特征及其动态变化进行了系统性地刻画，发现并解析了基因组微卫星稳定和不稳定病人的T细胞差异【4】。相关工作已于2018年10月29日，以“Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer”为题发表在Nature 杂志上。

在肿瘤微环境中，除淋巴细胞外，髓系免疫细胞（Myeloid cell）作为主要的抗原提呈细胞在肿瘤免疫中同样发挥重要的功能。多项靶向髓系免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage, TAM）和树突状细胞（Dendritic cell, DC ）的治疗策略已进入临床前试验。然而这些细胞在结直肠癌肿瘤微环境中的特征，其与T细胞等其他细胞的相互作用关系，以及其靶向药物的作用机理尚未得到全面阐释。

2020年4月16日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）、北大-清华生命科学联合中心（CLS）张泽民课题组联合美国安进（Amgen）公司Jackon G. Egen、Yu Xin团队和北京大学人民医院申占龙课题组在Cell上以Article形式发表了题为Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer的研究论文。该研究在单细胞水平对结直肠癌患者的肿瘤微环境，特别是浸润髓系细胞类群首次进行了系统性的刻画，分析了TAM和DC细胞的类群特征、谱系发育及其与T细胞和其他细胞间相互作用关系。基于以上结果，研究团队分别对接受anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂的小鼠模型进行单细胞测序，揭示了这两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略潜在的作用机理。此项国际领先的开创性工作，建立了结合肿瘤患者及小鼠模型的单细胞转录组来研究肿瘤免疫治疗的范例，可为人们研究其他疾病中免疫细胞以及开发新的治疗方案提供思路。

1. 结直肠癌肿瘤中浸润着两群状态迥异的巨噬细胞

研究人员首先使用10x及Smart-seq2两种技术对从结直肠癌患者中收集的免疫和非免疫细胞进行单细胞转录组测序，从中鉴定出包括T细胞、B细胞、先天性淋巴细胞（Innate lymphoid cell, ILC）、髓系细胞、上皮细胞、成纤维细胞等主要细胞类群及下属的40个CD45+的免疫细胞类群和12个CD45-的非免疫细胞类群（图1）。这些细胞亚群均具有特异性的表达特征，且在不同组织中呈现出不同的细胞类型富集特征。

图1 整合结直肠癌患者和小鼠模型的单细胞转录组研究思路

在对各细胞类群进行功能注释后，研究人员发现了一群富集于肿瘤内的FCN1+的单核细胞样细胞，并推测其可能是TAM细胞发育的前体，这与近期在小鼠模型上研究肠道组织巨噬细胞的发育模式相吻合【5】。研究者还发现肿瘤相关巨噬细胞可以被分为SPP1+ TAM和C1QC+ TAM两个具有不同发育来源 、不同细胞功能的细胞类群 （图2）。应用RNA velocity等多种谱系发育分析推断，C1QC+ TAM可能通过IL1B+的巨噬细胞发育而来，发挥细胞吞噬和抗原呈递的功能；而SPP1+ TAM可能由NLRP3+的组织驻留巨噬细胞发育而来，发挥促血管生成及促进肿瘤转移的功能。值得注意的是，结合肠炎病人及健康受试者的单细胞转录组数据【6】，研究人员首次分析发现，SPP1+ TAM特异性地富集在结直肠癌病人癌组织中，提示其可能在结直肠癌肿瘤发生发展中发挥重要作用。

图2 结直肠癌浸润细胞亚型相互作用网络及髓系免疫细胞发育路径

2. 细胞间相互作用网络提示结直肠癌髓系细胞的不同功能

为了研究结直肠癌内各细胞类群间的相互作用关系，研究人员利用Smart-seq2数据中各细胞类群的特征基因集及TCGA中结直肠癌的bulk样本，对各细胞类群间的相关性进行了 计算，并进而在癌旁组织和肿瘤内构建出“相关性关系网络（Correlative network）”。从所构建的细胞间相互作用网络中可以发现，TAM细胞和DC细胞与最多的细胞类群发生相互作用，构成了肿瘤内相互作用网络的核心节点 （图2）。值得注意的是，SPP1+ TAM和C1QC+ TAM也具有不同的细胞间作用关系，其中C1QC+ TAM主要与多种T细胞亚群发生相互作用，SPP1+ TAM则主要与肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblast，CAF）发生相互作用，这也与上述这两群细胞的主要功能相对应。两群经典的DC细胞（Conventional DC，cDC）分别与不同类型的T细胞相互作用。该研究中新建立的细胞间相互作用分析网络，有助于深入理解免疫细胞在肿瘤微环境中的不同功能。

3. 结直肠癌病人及小鼠肿瘤模型中浸润的保守的免疫细胞亚型

基于以上针对结直肠癌肿瘤微环境的解析，研究人员接着利用小鼠肿瘤模型来研究靶向不同髓系细胞类群对抗肿瘤免疫反应造成的影响。anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂是两种已进入前临床实验阶段的靶向髓系细胞的免疫治疗策略【7,8】。其中CSF1R是促进髓系细胞增殖和分化的重要受体，CD40则是TNF受体家族的成员，在DC细胞和T细胞间的信号传递中发挥重要功能。研究者分别在MC38和Renca两种小鼠模型中进行了anti-CD40与anti-CSF1R的治疗，并获得小鼠肿瘤浸润免疫细胞单细胞转录组图谱。与以上结直肠癌病人相比，DC和T细胞亚群在人和小鼠肿瘤中均有较高的一致性，如研究团队此前发现的激活的LAMP3+ DC【9】和BHLHE40+ Th1-like 细胞【4】。而尽管巨噬细胞在人鼠间的异质性高于其他免疫细胞类群，但在小鼠肿瘤中也存在着与SPP1+ TAM和C1QC+ TAM相似的巨噬细胞亚群。

4. 单细胞转录组揭示anti-CSF1R抑制剂作用机制

研究人员进而对治疗前后各细胞亚群比例及转录组的变化进行了分析，发现不同TAM细胞亚群对anti-CSF1R治疗的敏感程度不同 （图3）。Anti-CSF1R治疗耐受的TAM细胞亚群与结直肠癌患者中的SPP1+ TAM具有较高的相似性，且会特异性地高表达与促血管生成相关的基因Vegfa以及参与免疫抑制过程的基因Cd274和Arg1。Anti-CSF1R阻断型抗体会影响处在细胞周期中的巨噬细胞的增殖，并会特异性地删除掉一定比例的具有C1QC+ TAM特征的巨噬细胞，却不会对具有SPP1+ TAM特征的巨噬细胞起到作用，提示anti-CSF1R治疗后保留了在肿瘤中具有促进肿瘤血管生成的巨噬细胞。该研究对anti-CSF1R抑制剂在大部分肿瘤患者中单药疗效较差的原因给出了一个机制性解释。

图 3 靶向巨噬细胞的anti-CSF1R抑制剂作用机制

5. 单细胞转录组揭示anti-CD40抑制剂作用机制

Anti-CD40激动剂治疗可以使MC38小鼠的肿瘤体积缩小，且在与PD1阻断剂联合使用后还可以进一步抑制肿瘤的生长。然而，Anti-CD40激动剂治疗的机制及细胞亚群的变化有待深入阐释。本研究结合结直肠癌肿瘤患者和小鼠模型单细胞转录组分析发现，使用anti-CD40激动剂对MC38小鼠进行治疗后的第2天，激活态的Ccl22+ cDC1细胞即迅速做出响应，细胞比例显著增加。同时，在人鼠间保守的Bhlhe40+ Th1细胞比例也显著上升 （图4）。使用研究组此前开发的针对T细胞及其克隆性的分析方法STARTRAC【4】，研究人员发现anti-CD40激动剂治疗后，Bhlhe40+ Th1细胞的克隆增生显著增强。有意思的是，Bhlhe40+ Th1细胞所表达的Cd40lg转录本比例在治疗后也有显著上升，提示着anti-CD40激动剂治疗可以通过促进Bhlhe40+ Th1细胞表达更多的Cd40lg来进一步增强肿瘤中Bhlhe40+ Th1细胞与cDC1细胞间的相互作用。

相比CD4+ T细胞，CD8+ T细胞的响应速度则较慢，仅在治疗后的第10天，可以观察到Ccl5+ Tem细胞和Cxcr6+ Trm细胞比例的显著增加，值得注意的是，Tem细胞在淋巴结和肿瘤间的迁移能力，及该群细胞与Trm细胞间的转换能力也在治疗后有着显著的提升，提示此群Tem细胞可能与Stem-like T细胞相似，具有补充池（Pool）的功能。

图4 靶向DC细胞的anti-CD40激动剂作用机制

该研究共同第一作者北京大学博士后张雷博士（同时为Nature工作共同第一作者）表示，“该工作对此前团队针对结直肠癌肿瘤浸润T细胞的研究有很好的延续性和前瞻性。此前研究中发现MSI结直肠癌病人中会富集一群BHLHE40+ Th1-like细胞，认为可能是该类型患者免疫治疗响应更好的原因之一。而对于MSS病人的治疗响应仍缺乏认识。在此项结合人鼠单细胞转录组的工作中，团队首次发现靶向DC的治疗策略anti-CD40可以显著地提高此类细胞的水平，为MSS病人的临床治疗策略提供一定的指导。而靶向TAM的药物机制的研究，将大大有助于后续靶点的挖掘及新的治疗策略的开发。”

据悉，北大-清华生命科学联合中心CLS博士后张雷博士，北京大学生命科学学院博士生李子逸、Amgen公司Katarzyna M. Skrzypczynska博士为该论文的并列第一作者，北京大学BIOPIC，北京大学生命科学学院，ICG和CLS张泽民教授、Amgen科学家Jackson G. Egen博士和Xin Yu博士以及北京大学人民医院胃肠外科申占龙教授为该论文的共同通讯作者。Amgen炎症与肿瘤免疫部负责人欧阳文军博士对此研究提供了宝贵建议。

专家点评
叶幼琼、苏冰（上海交通大学医学院，上海市免疫学研究所）

肿瘤免疫疗法，例如免疫检查点阻断疗法（Immune checkpoint blockade，ICB），使得实体瘤治疗有了革命性进展，显著提高了许多恶性肿瘤患者的长期生存。但并不是所有肿瘤都对免疫疗法有响应，目前只有少部分肿瘤病人具有显著疗效。因此临床上迫切需要找到免疫治疗响应与否的具体机制以及相应的生物标记，以提高免疫疗法的效果。近年来，肿瘤微环境中的其它细胞成分，例如髓系细胞和其它免疫细胞亚群对肿瘤免疫治疗效果的影响也逐渐受到人们重视。CSF1R阻断疗法在多个癌种中可以抑制肿瘤相关巨噬细胞而增加CD8/CD4 T细胞的比例。然而，由于我们对肿瘤微环境复杂性的不完全了解，髓系细胞靶定治疗在肿瘤中的具体作用以及机制并没有被完全理解。

目前单细胞测序技术已经成为探究细胞类群多样性的有力手段，而不同的测序技术在细胞捕获和基因捕获效率上具有各自不同的优势。SMART-seq2测序技术利用孔板对单个细胞进行实验，通量虽相对较低，但每个细胞的基因捕获率相对较高；而10x Genomics测序技术利用基于微滴包被的原理，可实现一次实验获得较多的细胞数量，有效降低了单细胞测序的实验成本。二者结合可以充分发挥不同数据类型的优势，获得高分辨率的单细胞图谱以研究肿瘤微环境在免疫治疗中的作用。

4月16日，北京大学张泽民课题组结合SMART-seq2和10x Genomics两种单细胞测序技术，于Cell在线发表了题为“Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer”的研究论文。通过分析肠癌病人的癌组织、癌旁组织和外周血的单细胞转录组，获得高分辨率肠癌免疫细胞和非免疫细胞图谱。并揭示了单核细胞/巨噬细胞的组织特异性，以及主要髓系细胞亚群在小鼠和人中的保守性。其中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）主要来源于特异肿瘤浸润的单核细胞样细胞。区别于已知的M1和M2两种巨噬细胞，TAM呈现两种不同状态，一种与炎症相关（C1QC+ TAM），更倾向于和髓系细胞或T细胞相互作用；另一种与肠癌转移、血管生成相关（SPP1+ TAM），更倾向于与肿瘤相关成纤维细胞或内皮细胞相互作用。有意思的是，在小鼠实验中，SPP1+ TAM对 CSF1R阻断治疗具有耐药性，同时结肠癌病人中具有高浸润SPP1+ TAM和低浸润C1QC+ TAM都会有较差的预后，说明CSF1R单药治疗并不能完全消除TAM的促进肿瘤作用。其次作者确定肿瘤微环境中的三类树突状细胞（DC），包括LILRA4+ pDC、BATF3+ cDC1和CD1C+ cDC2，其中人的BATF3+ cDC1和小鼠的Ccl22+ cDC1/Clec9a+ cDC1保守，并意外发现BATF3+ cDC1同时和耗竭CD8 T细胞还有BHLHE40+ Th1样细胞相互作用。在小鼠实验中，作者发现CD40激动剂治疗能增加Ccl22+ cDC1细胞亚群比例而对其它DC亚群影响很小，并能同时增加效应记忆T细胞数量而减少耗竭CD8 T细胞数量，诱导肿瘤中Bhlhe40+ Th1样细胞的活化和扩增。此研究也从单细胞层面解析了CD40激动剂作用机制，为其和PD-1阻断剂的联合治疗提供了理论基础。

该工作全面地解析结肠癌的肿瘤微环境细胞图谱，阐明细胞与细胞之间的相互作用，以髓系细胞为靶标的CSF1R阻断剂和CD40激动剂的治疗为例，揭示髓系细胞靶定治疗的相关机制，对靶向肿瘤免疫微环境为基础的肿瘤治疗提供了更详细的理论基础，为今后靶定髓系细胞的精准治疗提供助力，具有重要的临床转化意义。针对该工作中CSF1R阻断剂治疗的耐受性，未来研究需要寻找调控SPP1+ TAM的一系列因子，设计合适抑制剂，并通过联合治疗的方式达到完全消除TAM。同时需要推动基于髓系细胞的细胞疗法的临床实验及相关生物学机制研究，以其提高免疫治疗疗效。

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