Science：肿瘤竟会将中性粒细胞的寿命延长3倍，促进血管生成

2024年1月12日，上海交通大学医学院附属仁济医院-上海市免疫治疗创新研究院的黄来源（Ng Lai Guan）团队在Science上发表了题为Deterministic reprogramming of neutrophils within tumors的研究论文，通过单细胞RNA测序、InfinityFlow等方法解析了肿瘤内中性粒细胞的分化途径，发现未成熟和成熟中性粒细胞进入肿瘤后均历经表观组、转录组和蛋白组水平上的重编程，转变成高表达dcTRAIL-R1的T3终末分化状态中性粒细胞，随后定位于具高糖酵解和乏氧特征的肿瘤组织核心区域，发挥促血管生成作用，支持肿瘤生长。该研究不仅解析了肿瘤中性粒细胞的特定分化途径，同时鉴定出可区分不同分化途径肿瘤中性粒细胞的表面标志物，有望为靶向中性粒细胞的肿瘤免疫治疗提供新靶点和新思路。

中性粒细胞在机体应对外界感染和损伤的免疫应答中，能够被迅速招募进入受损组织，发挥关键的免疫调节功能【1，2】。在癌症等病理情况下，肿瘤组织中的中性粒细胞浸润程度，与患者免疫治疗抵抗和不良预后紧密相关【3】。传统观点认为肿瘤内中性粒细胞为具有免疫抑制细胞亚群，并称其为粒细胞-髓源性抑制细胞（MDSC）【4】。随着肿瘤内中性粒细胞在密度、成熟度、表面标志物以及转录组等多维度水平的深入研究，肿瘤内中性粒细胞表现出复杂的特征和功能，然而肿瘤内中性粒细胞的分化发展途径，及其如何能够统一地重塑为促肿瘤功能仍未明晰，这也极大限制了基于中性粒细胞的肿瘤免疫治疗靶点研发。因此，该研究代表着中性粒细胞研究领域上的重大突破。

为探究肿瘤内中性粒细胞的异质性，研究团队通过单细胞RNA测序（scRNAseq）全面分析了原位胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）小鼠模型中的中性粒细胞，鉴定出肿瘤微环境中存在三个不同分化状态的T1、T2和T3中性粒细胞群体，其在转录组水平上有别于骨髓、脾脏和外周血中性粒细胞。通过对细胞核形态和成熟状态进行评估，T1和T2分别被确定为来自未成熟和成熟中性粒细胞的过渡性群体，T1、T2经过进一步重编程后发展为终末分化的T3中性粒细胞。此外，ATACseq揭示肿瘤内未成熟和成熟中性粒细胞均带有T3细胞群的特异性染色质可及性特征和转录因子活性，表明进入肿瘤组织的中性粒细胞不论其成熟与否均具有启动重编程的能力。

接着研究团队借助InfinityFlow技术鉴定出可用于区分肿瘤重编程的T3中性粒细胞的表面标志物dcTRAIL-R1，结合能够区分未成熟和成熟中性粒细胞的表面标志物CD101【5】，将肿瘤中性粒细胞分为dcTRAIL-R1-CD101-（T1未成熟）、dcTRAIL-R1-CD101+（T2成熟）和dcTRAIL-R1+CD101-/+（T3未成熟/成熟），并在转录组水平上对这种肿瘤中性粒细胞分类方法进行了验证。随后，研究团队在体外和体内追踪肿瘤重编程T3中性粒细胞群的产生及其动态变化规律，发现中性粒细胞进入肿瘤微环境或用肿瘤培养上清处理后均可上调其dcTRAIL-R1表达，并伴有T3特异性基因特征表达升高。研究团队借助于BrdU脉冲标记法发现肿瘤内中性粒细胞的半衰期相较于外周中性粒细胞显著增加，而当中性粒细胞进入肿瘤后其dcTRAIL-R1水平逐渐升高，并可维持至少5天，这表明T3表型与肿瘤内中性粒细胞寿命延长密切相关。

最后，研究团队研究了肿瘤内T3中性粒细胞的定位特点和在肿瘤发生过程中的作用，发现其主要位于肿瘤内一个独特的具乏氧、高糖酵解特征的生态位，且表达高水平的血管内皮生长因子α（VEGFα），并能诱导肿瘤核心区域的血管重塑。将T3中性粒细胞与肿瘤细胞共注射可显著加速肿瘤生长，反之使用抗dcTRAIL-R1抗体去除T3中性粒细胞或使用抗VEGFα抗体抑制其功能即可消除T3中性粒细胞对肿瘤生长的促进作用。此外，研究团队通过分析公开的单细胞数据发现多种小鼠肿瘤模型和临床PDAC患者中均存在多个中性粒细胞群重编程为T3中性粒细胞群的现象，并发现T3中性粒细胞基因表达特征与癌症患的不良预后之间存在显著关联，进一步说明T3中性粒细胞群在促肿瘤生长中的作用。

▲图 肿瘤内中性粒细胞历经共同分化路径重编程为促血管生成的中性粒细胞，支持肿瘤生长

未成熟和成熟的中性粒细胞进入肿瘤组织后分别分化为T1和T2过渡性细胞群，经过进一步重编程可融合为终末分化的T3中性粒细胞。T3中性粒细胞高表达VEGFα并定位于靠近肿瘤核心区域的一个具乏氧、高糖酵解特征的生态位，使其能够最大程度发挥促血管生成作用，进而促肿瘤生长。

综上所述，黄来源研究团队揭示了肿瘤微环境内中性粒细胞不论其成熟与否均具备适应环境信号的重塑功能，并且遵循共同的分化路径汇聚成为一种终末状态的T3促肿瘤生长表型。在机体稳态下，中性粒细胞响应组织信号而发生重塑的能力有利于组织稳态调节和免疫修复。而在机体病理情况下如肿瘤内，中性粒细胞的这种重编程能力反而会大量产生促血管生成的T3中性粒细胞，从而支持肿瘤生长。该研究表明中性粒细胞虽然寿命较短，但也具有根据不同组织信号调节其功能，以适应各异的组织微环境。该研究成果可能为针对中性粒细胞的新疗法奠定基础，且这种方法不仅仅对癌症有效，还可能对其他与中性粒细胞相关的疾病有效。此外，该研究的发现还为中性粒细胞的功能提供了新的见解。

此项工作开始于4年前，由髓系细胞生物学实验室团队成员完成。黄来源团队的博士后黄素芬、郭永恒、陈德利及附属仁济医院副研究员史长明为本文的共同第一作者，第一作者及联合通讯作者为黄来源实验室博士后，上海交通大学医学院附属仁济医院-上海免疫治疗创新研究院黄来源研究员为本文的主要通讯作者。

研究团队表示，该项研究得到了交大医学院和附属仁济医院的大力支持，尤其是在临床上的资源和专业支撑。

专家点评

张泽民（北京大学生物医学前沿创新中心，中国科学院院士）

中性粒细胞在肿瘤发展中发挥关键作用，并与患者不良预后和免疫治疗抵抗紧密相关。近年来众多研究揭示了中性粒细胞存在显著的异质性，然而肿瘤组织内中性粒细胞表型差异以及肿瘤内不同表型中性粒细胞的产生机制和对肿瘤进展的影响目前仍不明确。

上海交通大学医学院附属仁济医院-上海市免疫治疗创新研究院的黄来源研究员团队在Science上发表了题为Deterministic reprogramming of neutrophils within tumors的研究论文。他们采用原位胰腺癌小鼠模型（PDAC）结合单细胞测序技术，深入分析了肿瘤中性粒细胞的多样性，并聚焦于其成熟状态、发育起源和组织影响，详尽描述了中性粒细胞在肿瘤微环境中是如何进一步分化并发展成促进肿瘤的独特状态。同时利用ATACseq和空间转录组学技术揭示了中性粒细胞在迁移至低氧和糖酵解的肿瘤核心区域后所发生的关键性重编程过程。此外，他们借助高维流式细胞术明确了dcTRAIL-R1可作为多种小鼠肿瘤模型内重编程中性粒细胞的特异性表面标志物，并证明这种历经重编程的dcTRAIL-R1+中性粒细胞发挥促血管生成并支持肿瘤生长的功能。

此研究对中性粒细胞的不同状态及其之间的分化关系作了深刻剖析，揭示促肿瘤中性粒细胞是源于肿瘤微环境中的重编程，为解析肿瘤情况下的免疫应答提供了一种全新的视角。更为重要的是，此研究揭示了中性粒细胞具有适应不同组织微环境的内在能力，这一发现可用于开发针对中性粒细胞的免疫治疗策略，通过干预中性粒细胞病理性重编程过程，抑制其促肿瘤作用的同时保留其基本免疫功能。综上所述，这项研究不仅加深了我们对中性粒细胞在肿瘤发展的疾病机理中作用的认识，也为开发新型靶向中性粒细胞的肿瘤免疫治疗策略提供了重要的科学基础和坚实的理论支撑。

专家点评

胡小玉（清华大学医学院，教授）曾小敏（清华大学医学院，博士）

中性粒细胞作为天然免疫的第一道防线，在感染和损伤中发挥着重要的作用。由于中性粒细胞本身半衰期短且成熟后无法继续增殖，对于此类细胞的研究相对滞后。诸多的临床证据表明中性粒细胞在肿瘤进展中扮演重要角色，并与病人预后显著相关，因此探究中性粒细胞在肿瘤进展中的作用、寻找针对这群细胞的特异性靶点具有十分重要的临床意义。随着近年来技术的进步，中性粒细胞在生理及病理状态下的复杂性和异质性开始被人们所认识，其在癌症中扮演的角色也越来越受到大家的关注。但这其中肿瘤浸润中性粒细胞的各个亚群之间的相互关系和组织分布仍然有待阐明。

来自上海交通大学的黄来源课题组以小鼠原位胰腺癌模型为基础，通过多种高通量组学手段，鉴定出肿瘤特异性的三个中性粒细胞亚群T1、T2、T3，并证明来自血液循环的不成熟和成熟中性粒细胞会经过渡态T1、T2，最终都分化为终末态的T3。T3特异性表达dcTRAIL-R1, 富集在肿瘤中心缺氧和糖酵解区域并上调相关基因以应对缺氧和氧化压力。这一群T3高表达VEGFα并可以促进肿瘤中心区域的血管生成以缓解肿瘤中心区域的缺氧压力和营养压力。不同于以往认知的中性粒细胞的数小时至1天的存活期，肿瘤里的T3可以存活超过5天，特殊的组织分布和超长存活期使其极大促进肿瘤的生长，并与病人预后负相关。T1、T2、T3在不同肿瘤和不同物种间都是保守的。这说明，不同状态的中性粒细胞经肿瘤微环境的影响重编程为同一群T3中性粒细胞以支持肿瘤生长的分化路径是组织和物种间保守的，很可能代表着中性粒细胞命运趋同的一个普遍自然规律，只是被肿瘤这一病变组织绑架利用了。

该研究提出了一种新的理论去解释中性粒细胞的异质性，并揭示了亚群间的相互关系。组织浸润的中性粒细胞宿命般的同质化进程是所处组织微环境和粒细胞内在属性相结合的结果。但在其他正常组织或者其他的病理情况下，以及对于其他的粒细胞群体如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等是否存在类似的同质化分化机制及其相关作用仍有待阐明。靶向T3的疗法例如anti- dcTRAIL-R1 blockade也有望成为新的免疫治疗疗法。

原始文献：

Ng MSF, Kwok I, Tan L, Shi C, Cerezo-Wallis D, Tan Y, Leong K, Calvo GF, Yang K, Zhang Y, Jin J, Liong KH, Wu D, He R, Liu D, Teh YC, Bleriot C, Caronni N, Liu Z, Duan K, Narang V, Ballesteros I, Moalli F, Li M, Chen J, Liu Y, Liu L, Qi J, Liu Y, Jiang L, Shen B, Cheng H, Cheng T, Angeli V, Sharma A, Loh YH, Tey HL, Chong SZ, Iannacone M, Ostuni R, Hidalgo A, Ginhoux F, Ng LG.Deterministic reprogramming of neutrophils within tumors.Science. 2024 Jan 12;383(6679):eadf6493. doi: 10.1126/science.adf6493

参考文献

1. L. G. Ng, R. Ostuni, A. Hidalgo, Heterogeneity of neutrophils. Nat. Rev. Immunol. 19, 255–265 (2019). doi: 10.1038/s41577-019-0141-8; pmid: 30816340

2. L. G. Ng, Z. Liu, I. Kwok, and F. Ginhoux, Origin and heterogeneity of tissue myeloid cells: a focus on GMP-derived monocytes and neutrophils. Annu Rev Immunol 41, 375-404 (2023). doi.org/10.1146/annurev-immunol-081022-113627; pmid: 37126421

3. A. J. Gentles et al., The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat. Med. 21,938–945 (2015). doi: 10.1038/nm.3909; pmid: 26193342

4. V. Bronte et al., Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nat. Commun. 7, 12150 (2016). doi: 10.1038/ncomms12150; pmid: 27381735

5. M. Evrard et al., Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity 48, 364–379.e8 (2018). doi: 10.1016/j.immuni.2018.02.002; pmid: 29466759