Haematologica：通过二代测序验证DLBCL的LymphGen分类系统

验证LymphGen

弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）根据起源细胞分为ABC亚型和GCB亚型，但很多基于该分类的研究均失败，证实该简易系统的效力不足，因此近期多项研究利用高分辨率的基因组分析，根据基因改变谱进行亚分类；与 ABC/GCB相比，该方法可揭示更广泛的生物学异质性。例如NCI研究基于观察结果开发了一种概率分类算法LymphGen，能够将 DLBCL 细分为6个分子不同的组，即MCD、BN2、EZB、ST2、A53和N1，具有预后相关性。此外其他研究定义的生物分子cluster与 NCI 研究有所重叠。然而所有大规模研究得出的数据，均主要使用全基因组、全外显子组测序或大型综合靶标二代测序 (NGS) panel。然而在常规临床实践中，测序必须针对那些对立即进行临床治疗具有关键作用的有限基因集。

因此纪念斯隆·凯特琳癌症中心开展研究，旨在将LymphGen算法应用于经过验证的临床NGS检测，即纪念斯隆·凯特琳癌症中心(MSKCC) 血液学恶性肿瘤可操作癌症靶标的整合突变谱分析 NGS panel (Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets for Hematologic malignant NGS panel，MSKCC-IMPACT HEME，简称IMPACT)，研究结果近日发表于《Haematologica》。

研究结果

IMPACT检测目前用于临床DLBCL患者的管理，是一种经过临床验证的基于杂交捕获的检测方法，旨在检测与血液系统恶性肿瘤发生相关的遗传改变，包括单核苷酸变异(SNV)、小片段插入和缺失(INDEL)和拷贝数改变(CNA)。定制设计的DNA探针靶向400个关键致癌基因和抑癌基因的所有蛋白质编码外显子和邻近的内含子序列20bp。IMPACT使用唾液或剪下的指甲作为生殖细胞系DNA的来源，以确定血液肿瘤细胞的体细胞突变。

该研究使用 NCI DLBCL 队列的已发表数据评价仅含 IMPACT 组基因的 LymphGen 性能。通过将 NCI 变体识别数据过滤到 IMPACT panel上的基因中，将 LymphGen cluster应用于 NCI 队列病例上有限的400个基因集，证明使用基于原始panel的cluster作为基本事实，总体准确度为92%，灵敏度为86%，特异性为98%（图 1A 和1B）。共有58%的病例最终归类为6个亚型（或复合亚型）之一，仅略低于原始 NCI 报告中使用包括全外显子、深度扩增子和 RNA测序在内的综合方法（63%）。成功分类的病例包括：11.7%为MCD型、12.7%为BN2型、13.7%为EZB型、9.2%为A53型、5.3%为ST2型和0.8%为N1型，而原始 NCI LymphGen 研究包括13.9%为MCD型、16.1%为BN2型、13.2%为EZB型、6.6%为A53型、4.7%为ST2型和2.8%为N1型（图1C）。错误分类主要包括被综合 NCI panel或 IMPACT panel组视为“无法分类”（其他）的病例，如混淆矩阵所示（图1A）。

与 NCI 研究相似，大多数 EZB 亚型病例为 GCB 细胞来源；大多数 MCD 和 N1 亚型病例为 ABC 细胞来源；BN2和 A53 亚型同时携带 GCB 和 ABC 类型，而 ST2 亚型病例包含的 GCB 类型多于 ABC 类型（图1D）。使用靶向 IMPACT panel的基因进行分类，在58%的可分类病例中，34%的病例为高置信度（称为“核心”组，>90%的概率），19%的病例为低置信度（称为“扩展”组，50%-90%的概率）（图1C）。与原始 NCI 分配的47%“核心”和10%“扩展”组相比，较窄的 IMPACT 小组的识别置信度略低。归类为“核心”组的病例比例因亚型而异，其中N1亚型最高，ST2最低，代表这些亚型中分类的可信度（图1E）。在“核心”组中，IMPACT基因组的分类准确性增加至96%，灵敏度和特异性分别为86%和98%；表明如果通过核心方法进行定义，可以自信地将病例分为不同亚型（图 1F 和1G）

CNA 包含于 LymphGen 输入数据中，以使用完整算法。但在临床环境中，样本质量差或肿瘤含量低可能会影响拷贝数识别的准确性。为了探索当 CNA 不可用时，LymphGen使用 IMPACT 基因panel进行分类的准确性，仅将 BCL2 和 BCL6 易位信息的SNV、小 INDEL 和 FISH 应用于算法。总体平衡准确度为81%，总体灵敏度为83%，特异性为89%。A53 亚型如预期被省略，因为 A53 亚型的分类主要依赖于CNA。23例病例 (4.7%) 错误分类为“其他”（无法分类）组，表明缺乏 CNA 回降低算法将病例分类为亚类的能力。这些结果表明，优化的 CNA 信息对于 A53 亚型的分类至关重要，并进一步有助于增加整体分类准确性。

然后将LymphGen 应用于经 IMPACT 测序的396例 MSK DLBCL 队列（队列中320例同时具有 BCL2 和 BCL6 临床细胞遗传学结果）(数据见于https://www.cbioportal.org/study/summary?id=mbn_msk_2024)。将LymphGen算法应用于MSK DLBCL队列时，55%的病例可分配到其中一种亚型(MCD：10%， EZB：22%， BN2：10%， N1：3%， ST2：7%， A53：2%，复合型：2%)(图2A)。在这些病例中，约2/3为“核心”组，1/3为“扩展”组(图2C)。

基于Hans算法的遗传亚型和细胞起源的相关性与NCI队列相似。EZB亚型多为GCB型，而MCD和N1亚型多为non-GCB型；BN2、ST2和A53亚型混合携带GCB和non-GCB型(图3)。进一步研究“核心”组中各亚类的构成及其与COO分级的关系："核心"组148例(37.4%)，其中MCD为18.2%，EZB为44%，BN2为22%，N1为7%，ST2为7%，A53为2%。遗传亚型和细胞起源的相关性与所有病例中相似。

在MSK DLBCL队列中，各基因亚型的细胞遗传学和免疫表型与NCI队列相似。正如预期，BCL2易位富集于EZB亚型(54/67例，81%)，BCL6易位富集于BN2亚型(24/31例，77%)；BN2亚型与BCL6易位同时存在时，MYC易位更常见(6/39,15.3%)。部分EZB(7/86, 8.1%)、MCD(2/40, 5.0%)和ST2(2/27, 7.4%)亚型中也可见MYC易位。免疫组化染色评估所有病例的免疫表型，作为诊断工作的一部分。与生发中心表型一致，CD10、CD23和LMO2更多表达于EZB和ST2亚型，而MUM1更多表达于BN2、MCD、N1和A53亚型。有趣的是，50%(8例中有4例)的N1亚型通过免疫组化表达CD5和LEF1，提示部分N1亚型病例可能代表慢性粒细胞白血病的Richter转化。只有2例发生BCL2易位的病例属于无法分类组，提示BCL2易位是EZB亚型的稳健分类方法(图3)。此外，MSK队列的生存分析显示与其他研究中观察到的一致的趋势，但可能是由于队列的固有异质性和随访时间相对较短，因此未达到统计学显著性。

总结

作者通过临床验证的400基因靶向NGS panel IMPACT验证了LymphGen对DLBCL的遗传分类，具有较高的灵敏度和特异度，表明该分类可应用于常规临床实践。需要指出的是，在作者的临床实践中，由于详细的分析前检查而排除了不充分的样本，因此超过99%的DLBCL病例可成功进行测序；而其他工作流程的成功率可能有差异。该研究结果还表明，如果能够提高CNA的检测，分类的准确性将进一步提高。

该研究认为，使用高复杂性检测(如LymphGen)对DLBCL进行的基因组分类，可以通过精心设计的较小靶向NGS检测(如IMPACT)很容易转化为常规临床治疗。这样的检测panel提供了机会，可用于临床决策和选择患者参加风险适应性（risk-adapted）和生物标志物选择性临床试验。

参考文献

Zhu M-L, Drill E, Joffe E, Salles G, Delgado AR, Zelenetz A, Palomba ML, Arcila M, Dogan A. Validation of LymphGen classification on a 400-gene clinical next-generation sequencing panel in diffuse large B-cell lymphoma: real-world experience from a cancer center. Haematologica; https://doi.org/10.3324/haematol.2023.284565